Justeringer av noen av komponentene i en polymerase-kjedereaksjon (PCR) -reaksjon kan endre kvaliteten på utfallet, enten ved å forbedre eller redusere produktutbyttet og -kvaliteten eller ved å forbedre reaksjonsspesifikiteten og følsomheten. Parametre som påvirker sluttresultatet kan enten være fysiske (dvs. temperatur, syklus ganger) eller kjemisk (dvs. malkonsentrasjon, type enzym brukt). Følgende er flere viktige faktorer som påvirker suksessen til PCR.
01 Rengjør laboratoriebetingelser
Siden PCR er i stand til å oppdage et enkelt DNA-molekyl, er det viktig å opprettholde uberørte forhold i laboratoriet. Bruk alltid friske hansker, bruk sterile glassvarer, rør og pipettespisser og sterile løsninger, og rengjør arbeidsområdet før du begynner å jobbe.
Ta alltid kontrollreaksjoner uten mal-DNA og uten enzym, for å sikre at resultatene virkelig skyldes forsterkning av den rette prøven.
De fleste sørger for å ha sitt eget sett med løsninger som ikke deles for å gjøre feilsøking enklere, og utpekte pipetter er ofte satt til side for PCR bare. DNase- og RNase-fri PCR-rør, aerosolresistente pipettespisser og arbeid i en hette med UV-lys, er også måter å minimere problemer.
02 kjemiske komponenter
- Har 18 til 24 baser
- Har ingen sekundær struktur (dvs. hårnålsløyfer)
- Har balansert distribusjon av G / C og A / T par
- Er ikke komplementære til hverandre ved 3-fots-ender
- Har smeltetemperaturer (Tm) ca 5-10 grader Celcius under annealingstemperaturen, som vanligvis er mellom 55 og 65 grader Celcius
Tm for begge primere bør også være like for best resultat.
03 Reaksjonsblanding: Mal og Primers
Optimale primerkonsentrasjoner er mellom 0,1 og 0,6 mikromol / L. Mengden av mal varierer avhengig av typen av DNA (human, bakteriell, plasmid).
Med svært lave mengder mal finnes det andre strategier for å forbedre resultater, som økte syklusnumre eller bruk av "hot start". Test alltid nye primere med positiv kontrollreaksjon, for å være sikker på at de fungerer under dine spesifikke eksperimentelle forhold.
04 Reaksjonsblanding: Enzymaktivitet
Konsentrasjonen av MgCl2 i reaksjonsblandingen kan påvirke PCR-utfallet og kunne spille en viktig rolle i mer krevende reaksjoner. Magnesiumkation danner oppløselige komplekser med dNTP for å produsere det faktiske substratet som polymeraseenzymet gjenkjenner.
Like mengder av alle fire dNTPs bidrar også til å redusere polymerasefeilraten. Visse tilsetningsstoffer som betain, BSA, vaskemidler, DMSO, glyserol og pyrofosfatase kan også påvirke enzym-spesifisitet eller reaksjonseffektivitet.
05 Type Thermocycler
Når du handler for laboratorieutstyr, må du huske at noen termocyklere er mindre presise enn andre for å opprettholde nøyaktige, ønskede temperaturer.
Dette er et område hvor det går billig, vil ikke lønne seg i det lange løp når du står overfor en finjaktig reaksjon eller ved bruk av primere som krever et smalt utvalg av annealingstemperatur.
Tynnveggede reaksjonsrør designet for å passe til det nøyaktige merket av termocykler du bruker, bidrar også til å optimalisere reaksjonstemperaturene.
06 Syklusinnstillinger
Økt utbytte kan oppnås ved å øke forlengelsestiden om hver 20 syklus, for å kompensere for mindre enzym for å forsterke mer mal. Vanligvis er mindre enn 40 sykluser nok til å amplifisere mindre enn 10 malmolekyler til en konsentrasjon som er stor nok til å se på et etidiumbromidfarget agarosegel .