Gene kloning er en handling å lage kopier, eller kloner, av et enkelt gen. Når et gen er identifisert, kan kloner brukes i mange områder av biomedisinsk og industriell forskning. Genetikk er prosessen med kloning av gener i nye organismer eller endring av DNA-sekvensen for å endre proteinproduktet. Genetikk er avhengig av vår evne til å utføre følgende viktige prosedyrer.
01 Polymerase Chain Reaction
02 Restriksjon Enzymer
Oppdagelsen av enzymer kjent som restriktionsendonukleaser har vært avgjørende for proteinteknikk . Disse enzymene kutter DNA på bestemte steder basert på nukleotidsekvensen. Hundrevis av forskjellige restriktjonsenzymer , som er i stand til å kutte DNA på et tydelig sted, har blitt isolert fra mange forskjellige bakteriestammer. DNA kuttet med et restriktionsenzym produserer mange mindre fragmenter av varierende størrelse. Disse kan separeres ved hjelp av gelelektroforese eller kromatografi.
03 Elektroforese
Rensing av DNA fra en cellekultur, eller kutting av det ved hjelp av restriksjonsenzymer, ville ikke være til stor nytte hvis vi ikke kunne visualisere DNA-det vil si finne en måte å se om utdraget inneholder noe eller hvilken størrelse fragmenterer deg har kuttet den inn En måte å gjøre dette på er ved gelelektroforese. Geler brukes til en rekke formål, fra å se kutt DNA for å oppdage DNA-innstikk og knockouts.
04 Bli med to stykker av DNA
I genetisk forskning er det ofte nødvendig å knytte to eller flere individuelle tråder av DNA, for å skape en rekombinant streng eller lukke en sirkulær streng som er kuttet med restriksjonsenzymer. Enzymer kalt DNA ligaser kan skape kovalente bindinger mellom nukleotidkjeder. Enzymerne DNA-polymerase I og polynukleotidkinase er også viktige i denne prosess for å fylle hull eller fosforylere henholdsvis 5'-ender.
05 Valg av lite selvrepliserende DNA
Små sirkulære stykker av DNA som ikke er en del av et bakteriegenom, men som er i stand til selvreplikasjon, er kjent som plasmider. Plasmider blir ofte brukt som vektorer for å transportere gener mellom mikroorganismer. I bioteknologi, når først genet er blitt forsterket og både genet og plasmidet kuttes av restriksjonsenzymer, blir de ligert sammen og genererer det som er kjent som et rekombinant DNA. Viral (bakteriofag) DNA kan også brukes som en vektor, som kan kosmider, rekombinante plasmider som inneholder bakteriofaggener.
06 Metode for å flytte en vektor til en vertscelle
Prosessen med å overføre genetisk materiale på en vektor, slik som et plasmid, inn i nye vertsceller, kalles transformasjon. Denne teknikken krever at vertscellene er utsatt for en miljøendring som gjør dem "kompetente" eller midlertidig permeable for vektoren. Elektroporation er en slik teknikk. Jo større plasmidet er, desto lavere effektivitet som det tas opp av celler. Større DNA-segmenter blir lettere klonet ved hjelp av bakteriofag, retrovirus eller andre virale vektorer eller kosmider i en metode som kalles transduksjon. Fag- eller virusvektorer brukes ofte i regenerativ medisin, men kan føre til at DNA settes inn i deler av kromosomene der vi ikke vil ha det, forårsaker komplikasjoner og til og med kreft.
07 Metoder for å velge transgene organismer
Ikke alle celler vil ta opp DNA under transformasjon. Det er viktig at det finnes en metode for å oppdage de som gjør det. Generelt bærer plasmider gener for antibiotikaresistens, og transgene celler kan velges basert på ekspresjon av disse gener og deres evne til å vokse på medier som inneholder det antibiotika. Alternative valgmetoder avhenger av tilstedeværelsen av andre reporterproteiner, slik som x-gal / lacZ- systemet, eller grønt fluorescensprotein, som tillater valg basert på farge og fluorescens, henholdsvis.