Graden av proteinrenhet som kreves avhenger av den tilsiktede sluttbruk av proteinet.
For noen anvendelser er et uønsket ekstrakt tilstrekkelig. For andre anvendelser, som for eksempel i matvarer og legemidler, er det imidlertid nødvendig med et høyt renhetsnivå. For å oppnå dette, anvendes flere proteinrensingsmetoder typisk i en serie av rensingstrinn.
Hvert proteinrensingstrinn resulterer vanligvis i en viss grad av produkttap. Derfor er en ideell proteinrensningsstrategi en der det høyeste nivået av rensing er nådd i de minste trinnene. Utvalget av hvilke trinn som skal brukes er avhengig av størrelsen, ladningen, oppløseligheten og andre egenskaper av målproteinet. Følgende teknikker er mest hensiktsmessige for rensing av et enkelt cytosolisk protein. Rensing av cytosoliske proteinkomplekser er mer komplisert og krever vanligvis at forskjellige metoder anvendes.
Første trinn for proteinrensing
Det første trinnet i å rense intracellulære (inne i cellen) proteiner er fremstillingen av et rå ekstrakt .
Ekstraktet vil inneholde en kompleks blanding av alle proteiner fra cellecytoplasma, og noen ekstra makromolekyler, kofaktorer og næringsstoffer. Råkstraktet kan brukes til enkelte anvendelser innen bioteknologi, men hvis renhet er et problem, må etterfølgende rensingstrinn følges.
Råproteinekstrakter fremstilles ved fjerning av cellulær rusk fremstilt ved cellelyse, som oppnås ved bruk av kjemikalier og enzymer , sonikering eller fransk press. Ruskene fjernes ved sentrifugering, og supernatanten gjenvinnes. Råpreparater av ekstracellulære proteiner kan oppnås ved ganske enkelt å fjerne cellene ved sentrifugering.
For visse bioteknologiske anvendelser er det en etterspørsel etter termostabile enzymer : Enzymer som kan tåle høye temperaturer uten denaturering, og samtidig opprettholde en høy spesifikk aktivitet. Organer som produserer dem kalles noen ganger ekstremofiler. En enkel tilnærming til å rense et varmebestandig protein er å deature de andre proteinene i blandingen ved oppvarming og deretter avkjøle oppløsningen (slik at det termostabile enzym kan reformeres eller gjenoppløses om nødvendig. De denaturerte proteiner kan deretter fjernes ved sentrifugering.
Intermediate Purification Steps
Tidligere var et vanlig andre trinn for å rense et protein fra et råekstrakt ved utfelling i en løsning med høy osmotisk styrke (dvs. saltløsninger). Nukleinsyrer i råekstraktet kan fjernes ved utfelling av aggregater dannet med streptomycinsulfat eller protaminsulfat.
Proteinutfelling gjøres vanligvis ved bruk av ammoniumsulfat som saltet.
Ulike proteiner vil utfelle i forskjellige konsentrasjoner av ammoniumsulfat . Generelt sett inneholder proteiner med høyere molekylvekt utfelling i lavere konsentrasjoner av ammoniumsulfat. Saltutfelling fører vanligvis ikke til et sterkt renset protein, men kan bidra til å eliminere noen uønskede proteiner i en blanding og konsentrere prøven. Salter i løsningen fjernes deretter ved dialyse gjennom porøs cellulose-rør, filtrering eller geleksklusjonskromatografi.
Moderne bioteknologiske protokoller utnytter ofte de mange kommersielt tilgjengelige kittene som gir klare løsninger for standardprosedyrer. Proteinrensing utføres ofte ved bruk av filtre og preparerte gelfiltreringskolonner. Alt du trenger å gjøre er å følge instruksjonene og legge til riktig volum av riktig løsning og vent den angitte tidsperioden mens du samler elueringsmiddelet (det som kommer ut i den andre enden av kolonnen) i et nytt reagensrør.
- Kromatografiske metoder kan påføres ved hjelp av benkolonner eller automatisert HPLC-utstyr. Separasjon ved HPLC kan gjøres ved omvendt fase, ionbytter eller størrelsesekskluderingsmetoder, og prøver oppdaget av diode array eller laser teknologi.
Proteinvisualisering og vurdering av rensing
- Omvendt fase kromatografi (RPC) separerer proteiner basert på deres relative hydrofobiciteter . Denne teknikken er svært selektiv, men krever bruk av organiske løsningsmidler. Noen proteiner blir permanent denaturert av løsemidler og vil miste funksjonalitet under RPC. Derfor anbefales ikke denne metoden for alle anvendelser, spesielt hvis det er nødvendig for målproteinet å beholde aktivitet.
- Ionbytterkromatografi refererer til separering av proteiner basert på ladning . Kolonner kan enten fremstilles for anionbytter eller kationbytting. Anionbytterkolonner inneholder en stasjonær fase med en positiv ladning som tiltrekker negativt ladede proteiner. Kationbytterkolonner er de omvendte, negativt ladede perler som tiltrekker positivt ladede proteiner. Eluering av målproteinet (-ene) gjøres ved å endre pH i kolonnen, hvilket resulterer i en forandring eller nøytralisering av de ladede funksjonelle grupper av hvert protein.
- Størrelsesekskluderingskromatografi ( gelfiltrering ) separerer større proteiner fra små, siden de større molekylene beveger seg raskere gjennom den tverrbundne polymeren i kromatografikolonnen. De store proteiner passer ikke inn i porene i polymeren, mens mindre proteiner gjør det, og tar lengre tid å reise gjennom kromatografikolonnen via deres mindre direkte rute. Eluat samles i en serie rør som separerer proteiner basert på elueringstid. Gelfiltrering er et nyttig verktøy for konsentrering av en proteinprøve siden målproteinet oppsamles i et mindre elueringsvolum enn det som ble tilsatt til kolonnen. Lignende filtreringsteknikker kan brukes under storskala proteinproduksjon på grunn av kostnadseffektiviteten.
- Affinitetskromatografi er en veldig nyttig teknikk for "polering" eller fullføring av proteinrensingsprosessen. Perler i kromatografikolonnen er kryssbundet til ligander som binder spesifikt til målproteinet. Proteinet blir deretter fjernet fra kolonnen ved å skylle med en oppløsning som inneholder frie ligander. Denne metoden gir de reneste resultatene og høyest spesifikk aktivitet i forhold til andre teknikker.
- SDS-PAGE er polyakrylamidgelelektroforese, utført i nærvær av SDS (natriumdodecylsulfat) som binder til proteiner som gir dem en stor netto negativ ladning. Siden kostnadene for alle proteiner er ganske like, separerer denne metoden dem nesten helt basert på størrelse. SDS-PAGE brukes ofte til å teste renheten av protein etter hvert trinn i en serie. Som uønskede proteiner blir gradvis fjernet fra blandingen, blir antall bånd visualisert på SDS-PAGE-gelen redusert til det bare er ett bånd som representerer det ønskede protein.
- Immunoblotting er en proteinvisualiseringsteknikk anvendt i kombinasjon med affinitetskromatografi. Antistoffer for et spesifikt protein blir brukt som ligander på en affinitetskromatografikolonne. Målproteinet oppbevares på kolonnen, deretter fjernet ved å skylle kolonnen med en saltoppløsning eller andre midler. Antistoffer knyttet til radioaktive eller fargemerkede midler hjelper til med påvisning av målproteinet når det er separert fra resten av blandingen.
kilder:
Zubay G. 1988. Biokjemi, 2. utgave. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Proteinrensningshåndbok, utgave AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.